Любопитно

История на изкуственото осеменяване

АБСТРАКТ: Изкуственото осеменяване (ИО) е първата заначителна биотехнология приложена за подобряване на репродукцията и генетиката на селскостопанските животни (ССЖ). То има огромно влияние по целият свят за много видове животни и в частност за млечното говедовъдство. Възприемането на технологията на ИО в световен мащаб стимулира развитието на други технологии, като криоконсервацията и сексирането на сперма, регулиране на еструса, получаването, замразяването, култивирането и трансфера на ембриони, а също така и клонирането. Развиват се нови високоефективни методи за оценка на разплодниците. Историята на ИО се разглежда най-вече от точка на млечното говедовъдство, тъй като там влиянието за генетически прогрес и контрол на венерическите заболявания и най-голямо. Други видове животни включени в този материал са свинете, конете, овцете, козите, кучетата, зайците , птиците и застрашени видове. Фокусира се на най-значителните крайъгълни камъни в ИО заедно с личностите, които са свързани с това развитие. Много от тези пионери помагат за развитие на нова генерация от учени специализиращи в репродуктивната физиология и биотехнологиите. Заедно с историческите факти в материала са включени моменти предаващи атмосферата на времето. Много от референциите ще отведат читателя назад във времето преди електронните мрежи така, че тези цитати на класически изследвания не могат да бъдат намерени с натискането на няколко клавиша от вашата компютърна клавиатура.

Въведение

ИО във формата му практикувана от пчелите и много други летящи насекоми играе и играе важна роля при възпроизводството на растенията за много дълго време. Използването на ИО при животните е скорошно човешко откритие. Съществуват недокументирани истории за арабите, които получавали сперма след случката от кобили принадлежащи на конкурентни групи и използвали тази сперма за осеменяване на собствените си кобили.
Все пак нашата история започва с документирани факти, показващи значителни постижения. По тази причина по нататъшният разказ е хронологичен. Много от разработките в ИО стават преди 1980 години и ерата на електронните мрежи. Така че в текста са включени и по-ранни референции. Развитието, което направи ИО най-важната приложна биотехнология в животновъдството и до днес, включва подобрени методи на управление на мъжките животни и получаване, преценка и съхраняване на сперма, а също така и осеменяване. Откриването на еструса и контрол на цикъла при женските животни, също са много важни постижения. Развитието на ИО е забележителна история на неуморни работници, посветени на преследване на знания и заменянето на фантастиката с факти и тяхното приложение след това.
Ще наблегнем на млекодайното говедовъдство, защото ИО има най-голям генетичен ефект при този вид ССЖ. По-задълбочен преглед на техническите аспекти на ИО може да намерите в много от книгите по ИО и възпроизводство (Walton, 1933;
Anderson, 1945; Cole and Cupps, 1959; Maule, 1962; Mann, 1964; Milovanov, 1964; Perry, 1968; Salisbury et al., 1978; Watson, 1978; Brackett et al., 1981; Foote,
1981; Herman, 1981; Cupps, 1991). Достапни са също и много допълнителни прегледи свързани с ИО (Nishikawa, 1962, 1964, 1972; Asdell,1969; Bonadonna, 1975; Bonadonna and Succi,1976; Foote, 1999).

Ранна история на ИО

Льовенхук (Leeuwenhoek, 1678) и неговият помощник Хам (Hamm) са първите личности, които са наблюдавали сперматозоиди, които те нарекли „анималкулес" ("animalcules"). Льовенхук не е имал специално образование, така че той не е учил латински, езика на науката, но все пак той е бил способна личност и полирал талково прецизно оптични лещи /една от тях съществува и до днес с 270 кратно увеличение/, така че е било възможно да наблюдава и сперматозоиди.

Microscope

Микроскопът на

Льовенхук

По най-подробен начин и с вдъхновена обективност Антони ван Льовенхук излага наблюденията си в своите писма до Лондонското кралско дружество, на което през далечната 1680 г. е приет за член, а по-късно е приет за член и на Парижката академия на науките.
Минава още един век преди да бъде извършено първото успешно ИО от Спаланцани (Spallanzani ,1784) на куче, от което след 62 дни се ражда три кученца. Спаланцани, който поначало е обучаван за свещеник, имал голям интерес към природна история. Той е професор по природна история в Павия още на 25 годишна възраст. Спаланцани събира и квалифицира различни видове пеперуди, миди и други морски и сухоземни животни. Неговият дом е претрупан с тези колекции, което предизвиква голямо неудобство за роднините му живеещи там, но той използва тези колекции за задълбочени и сравнителни анализи, за да разкрие много от физиологичните характеристики на животните свързани със здравето им.
Други 100 години минават преди Хепи (Heape, 1897) и други учени в различни страни да докладват, че изкуствено осеменяване е използвано успешно в изолирани случаи на зайци, кучета и коне. Хепи е изключителен репродуктивен биолог и изследванията базира на връзката между сезонността и възпроизводството. Тази негова работа прави възможно Кеймбридж за стане световен център за репродуктивни изследвания (Marshall, Hammond, Walton, and students such as M. C. Chang).

ИО става фокус на изследванията

Пионерни усилия за утвърждаването на ИО като практична процедура започват в Русия през 1899 г от Иванов. През 1907 г. Иванов изследва ИО при ССЖ, кучета, лисици, зайци и птици. Някои от неговите изследвания специално при конете са включени и в работата му на английски (Ivanoff, 1922) изпратена на 21 юни 1922 г. и публикувана за рекордно кратко време през юли 1922 г. в списание за селскостопански науки (Journal of Agricultural Science). Той разработва разредители за сперма и обучава техници, които да избират превъзходни жребци и да умножат тяхното потомство чрез ИО. Голяма част от работата по ИО в Русия е продължена по-късно от Милованов (1938), описана в текст преведен на английски (Milovanov, 1964). Той създава голям проект за развъждане на овце и крави. Той не изпраща поръчките си за консумативи по „електронна поща". В собствената си работилница проектира и прави практични изкуствени вагини и други съоръжения, много сходни с тези използвани и днес. Това е огромно подобрение на по-раншните методи за получаване на сперма чрез гъбести материали поставени във вагината на женските животни подложки.
Развитието на ИО от Иванов стимулира също и изследванията извън Русия. Японски учен д-р Ишикава следвал заедно с Иванов. Той се връща в Япония и започва подобна програма при конете в 1912 г. (Nishikawa,1962). С тази програма постепенно се развива прилагането на ИО в Япония при крави, овце, свине и птици. Включват се и други японски изследователи (Ito, Niwa, Sato, Yamane, etc.). Тъй като голяма част от изследванията са публикувани на японски, а много малко хора на запад знаят японски, в западния свят се знаело малко за тези изследвания докато Нива (1958) и Нишикава (1962, 1964, 1972) обобщили изследванията си на английски.
Новините за широко използване на ИО в Русия след доклад на Иванов (1922), получават широко разпространение в западния свят в книгата за ИО от Уолтън (1933). Уолтън провежда редица експерименти включително и изпращане за първи път сперма от кочове за Полша, която била успешно използвана два дни по-късно за осеменяване на овце. Но въпреки всичко комерсиалното ИО не се развива бързо във Великобритания.
По същото време, началото на 20-те години на ХХ век в България се провеждат първите успешни експерименти по ИО на овце и кобили. През 1923 г. в жребцова станция в Перник, д-р М. Минчев извършва изкуствено осеменяване на кобили. През 1934 г. д-р К. Минев публикува и първата брошура по ИО.
Някои разработки в ИО в частност тези за конете са били направени в началото на ХХ век в Дания. Едуард Соренсен от Кралския ветеринарен колеж в Копенхаген, Дания е бил запознат с Руските разработки, заедно с Гилинг-Холм, Соренсен организира първата кооперативна организация по ИО в млечното говедовъдство в Дания през 1936 г. В програмата са включени 1 070 крави за първата година и 59% от тях се заплождат, малко по-добре от естественото покриване в същите стада. Това се явява като важен стимул за понататъшното развитие на ИО в млечното говедовъдство в САЩ и други западни страни.
Датските ветеринари създават метод за ректовагинална фиксация на цервикса, който позволява семенна течност да бъде депозирана дълбоко в цервикса или в тялото на матката. Тази техника дава огромно предимство защото значително по-малък брой сперматозоиди са необходими за осеменяването на всяко крава. Друго датско изобретение е опаковането на семенната течност в пайети (сламки) (Sørensen, 1940). Навремето той видял деца на рождения ден на дъщеря му да пият пънч /коктейл от плодови сокове/ с целофанови сламки и установил че вече е намерил сламката, която му е необходима. По-късно Касу (1964) произвежда сламки, които получават комерсиално разпространение в цял свят. Така че френската пайета е модифицирана датска сламка. За Д-р Соренсен е известно също че е бил труден изпитващ по анатомия. Да положиш успешен изпит при него било като „камила да влезе през иглени уши".
Междувременно много по ранните изследвания на Спаланцани в Италия довели до развитието на ИО на кучета от Амантея през 1914 (Perry, 1968). Тази работа служи за модел на руската разработка на изкуствена вагина за бици, жребци и кочове. Друг италианец Бонадонна (1937), продължава изследванията върху ИО при различни животински видове. Неговият ентусиазъм за потенциалната ценност на ИО заедно с Лагерльов се изрази в организирането на много успешен международен конгрес по изкуствено осеменяване и възпроизводство на животните, който става на всеки 4 години. Първият се е състоял в Милано през 1948 год. Когато веднъж гости на д-р Бонадонна споделят изключителната красота на ренесансовото изкуство в Италия, той им казва: „Да, но запомнете, че бъдещето изисква да не употребявате твърде много време мечтаейки за миналото"
В Швеция, Лагерльов става известен със своите изследвания на проблемите на безплодието при бици. Тази негова изследователска дейност е стимулирана от посещението му при д-р Уилиямс от университета в Корнел, който е публикувал методи за оцветяване на сперматозоиди. Междувременно Лагерльов завършва своята класическа докторска дисертация "Изменение на сперматозоидите и на тестиси на бици с ограничена или липсваща фертилност" (Lagerlo¨f, 1934). Той създава група с глобално влияние за обучение на ветеринари в различни аспекти на фертилността и ИО. Други скандинавци като Блом (1950), следвайки тези разработки публикуват редица работи на абнормална морфология на сперматозоидите (Barth and Oko, 1989). Тези пионери са мислители и реализатори и обучават много последователи.

Съвременни развития на ИО в млекодайното говедовъдство

Феноменално нарастване на използването на ИО става през 40-те години на ХХ век в САЩ. Процедурите разработени в САЩ се внедряват в целия свят (Salisbury
et al., 1978). През 1936, Броунел осеменява крави в университетското стадо на Корнел и започва други разработки през късните 30 години на ХХ век в Минесота и Висконсин. През 1938 г. е създаден кооператив по ИО в Ню Джърси, моделиран по Датската система (Perry,1968). Следва още един кооператив създаден през 1938 в щата Ню Йорк (Sipher, 1991). Развитието на кооператива New York Artificial Breeders, по настояще Genex, в Итака, Ню Йорк направи възможно тясното сътрудничество между фермерския кооператив и изследователите и консултантите в университета в Корнел. Тази високо продуктивна връзка има за резултат експерименталното осеменяване на стотици хиляди крави и публикуването на повече от 100 научни разработки (Foote, 1998) върху селекцията на бици производители, оценката на тестисите, получаване, преценка и обработка на сперма; и проверка на фертилността. Съвременното състояние на ИО в много страни е сумирано по настояще от (Malafosse and Thibier,1990; Foote, 1999).

Преценка на сперма

Най-широко използвания тест за качество на сперматозоидите от началните фази на развитие на ИО и до днес е оценката на частта на нормалните сперматозоиди с праволинейно настъпателно движение (Anderson, 1945; Maule,1962; Salisbury et al., 1978). Ключов фактор при тази оценка се явява микроскоп с добро качество. Към методите за преценка на сперматозоидите светлинен микроскоп, фазово контрастни микроскопи, различни видове оцветяване, проточна цитометрия, компютърен спермоанализатор (CASA), които допринесоха за подобряване количественото определяне на движението на сперматозоидите (Graham,1978; Salisbury et al., 1978; Pace et al., 1981; Garner et al., 1997; Foote, 1998). С появата на замразена сперма преценката на преживяемостта след размразяването става много важна. Оценката на акрозомалния статус на сперматозоидите беше подобрена с разработките на Саке и Маршал (1968). Техники за оценка на морфологията на сперматозоидите са разгледани от Барт и Око (1989).
Обема на еякулата и концентрацията на сперматозоидите са два други критични компонента при преценката на спермата, защото те определят общо броя на получените сперматозоиди. Първоначално обема се измерва в градуирани контейнери, днес по често обема е определян по-точно чрез теглото, като се има предвид, че относителното тегло е 1.0. Сперма от жребци е била теглена в миналото (Nishikawa, 1959). Бързи оптически методи за измерване на концентрацията на сперматозоидите заменят трудоемките процедури с хемоцитометри (броителни камери).
Оплодителната способност /фертилност/ е най-надеждния тест за качеството на спермата. Често не е възможно да се измери директно, така че са развити множество тестове за косвено измерване на този показател в допълнение на подвижността и морфологията, като например хипоосмотичен тест, мукозна или гелна перфорация, цялостност на ДНК, корелиращи с фертилността (Graham, 1978; Saacke, 1981;Foote, 1998, 1999). Конкуриращо оплождане (Beatty,1960; Saacke, 1981; Dziuk, 1996; Foote, 1998) със смесена сперма от различни разплодници дава друг ефикасен начин за рангиране на фертилността на разплодниците при използване на ин витро тест или осеменяване на животните. Но трябва да се знае, че общо взето не е практично да се смесва сперма при използване на изкуствено осеменяване за комерсиални цели, когато трябва да се доказва бащинство. При комерсиалното ИО е развит евтин метод за оценка на фертилността, който се базира на крави-повторки като основен компонент от програмите за ИО (Thompson and Salisbury, 1947). Това направи възможно сравняването на фертилността на биците, техниците осеменители, процедурите за обработка на сперма и даже показателите на стадата в производствени условия и предостави забележителна нова система за записване на ефективността от осеменяване. Други изследователи твърдо настояват за използване на диагностика на бременността за тази цел, но е ясно че този метод обхваща само малък брой крави, използва се спорадично и не е възможно централизираното събиране и оценка на данните. Ефективността от метода на повторките за наблюдение на фертилността днес е намалена поради множество доставчици на сперма на индивидуалните ферми, с което се затруднява проследяемостта.

Разредители на сперма, охлаждане на сперма и степен на разреждане

Първоначално най-важният проблем, който е трябвало да бъде разрешен е метод за съхраняване на сперма достатъчно дълго, за да бъде транспортирана за използване във фермите. Това първо подобрение на процедурите на ИО става в САЩ и е разработката на жълтъчно-фосфатен разредител за сперма (Phillips and Lardy, 1940). Салисбъри и сътрудници (1941) подобряват тази среда прибавяйки към жълтъка от яйце като буфер натриев цитрат. Преживяемостта на сперматозоидите при температура 50C позволява използването на спермата до три дни. Цитрата разпръсква мастните глобули в яйчния жълтък, правейки сперматозоидите видими при микроскопска преценка. Този разредител се използва по целия свят за сперма от бици. По-късно към него е добавен глицерин за криоконсервация на сперма от бици.
Следващият голям стимул за развитието на ИО в млекодайното говедовъдство е подобряването на оплодителната способност с 15 % в резултат на по-добър метод за първоначалното предпазване на сперматозоидите от студения шок (Foote and Bratton, 1949) и контрола на някои венерически болести чрез добавка на антибиотици (Almquistet al., 1949; Foote and Bratton, 1950). Разредителят на университета в Корнел (Foote and Bratton, 1950), съдържащ смес от антибиотиците пеницилин, стрептомицин и полимиксин Б, е използван години наред като стандарт. Много години са необходими за премахване на заболяванията на биците. През това време инвитро третирането на семенната течност с антибиотици предотвратява предаването на редица болести по полов път. Антибиотиците все още се включват в разредителите, като защитна „застраховка" срещу възможна контаминация. Тази обработка на спермата спести стотици милиони долари на млекодайното говедовъдство в света. Не са заявени патенти, и нито университета в Пенсилвания, нито университета Корнел получават обезщетения. Моралното възнаграждение е голямата услугата към селското стопанство. Растежа на ИО сега е подсигурен, защото фермите, които използват само ИО елиминират венерическите болести, намалява ембрионалната смъртност и е постигната висока заплодяемост. С бързото разпространение на ИО търсенето на сперма от популярни бици се увеличава. Най-простия начин да се посрещне това търсене е да се „разтегне" всеки еякулат при използване на по-малко сперматозоиди за едно осеменяване, при условие че това може да бъде постигнато без да се компрометира фертилността. Салисбъри и сътрудници публикуват няколко класически разработки (Salisbury et al., 1978; Foote, 1998) ясно потвърждаващи концепцията че са необходими само няколко милиона сперматозоиди за едно плодотворно осеменяване. При провеждането на тези експерименти Салисбъри е критикуван от някои, които обявяват, че „разреждането" на спермата е като „разводняване" на млякото. В последствие Фути и Братон (1950) предлагат думата „extender (удължител)", защото жълтъчно-цитратно-антибиотичната среда подобрява и удължава полезното използване на спермата. Фути предлага думата „suspender (поддръжник)". Крайният резултат от тези експерименти е това, че разреждането на спермата може да бъде увеличено най-малко 25 пъти. Броят сперматозоиди за едно осеменяване на свежа сперма е намален от повече от 100 х106 сперматозоида на осеменяване до 4 х106 сперматозоида на осеменяване (Salisbury et al., 1978; Foote, 1998). Заедно с усилената работа в лабораторията аспирантите на Салисбъри си спомнят и прекараните релаксиращи часове с вкусна храна в неговия дом.
Жълтъчният разредител е подобрен при създаването на разредителя на университета в Корнел (CUE, Foote et al., 1960), който резултира в най-високата фертилност постигната при ИО на стотици хиляди крави. (Salisbury et al.,1978; Foote, 1998). Шанон посещава Корнелския университет през втората половина на 50-те години на ХХ век и модифицира разредителя (Shannon et al., 1984) за използването му със свежа сперма в интензивния размножителен период в Нова Зенландия. Добавени са капроикова (хексанова) киселина (CH3(CH2)4COOH) и каталаза заедно с 5% яйчен жълтък от обема за получаването на "Caprogen", ефективен разредител за запазване на сперма от бици при умерена стайна температура в Нова Зенландия, с минималното количество от 2х106 сперматозоиди на осеменяване. Много изследователи (Salisbury et al., 1978; Foote, 1998) докладват, че обема на яйчния жълтък използван първоначално може да се намали особено при стайна температура и че каталазата може да има благоприятен ефект при такава температура.
Млякото също е широко използвано като разредител. След доклад на Михайлов (1950), Алмквист и сътрудници (Thacker and Almquist, 1953; O'Dell and Almquist, 1957; Almquist and Wickersham, 1962) публикуват статии за използване на обезмаслено мляко създавайки оптимални процедури за детоксификация на млякото и добавянето на глицерин за замразяването на сперма. Разредителят с мляко и глицерин е използван от много организации и до днес.

Сексуално поведение на биците, интензивно получаване на сперма и потенциал на биците

За да бъде посрещнато голямото търсене на сперма от определени бици, получаването на максималния брой сперматозоиди от бик е един от подходите за увеличаване на броя осеменявания от бик. Ранни изследвания върху сексуалната подготовка и интензитета на получаване на сперма са започнати от Братон и колеги (Collins et al.,1951; Bratton and Foote, 1954; Hafs et al., 1959) интензивните изследвания на Алмквист и сътрудници включван млекодайни и месодайни бици (Hale and Almquist, 1960;Amann, 1970; Almquist, 1973, 1982). Тези колективни изследвания имат за резултат определянето на важността на сексуалнта реакция на индивидуални бици и прилагане на стимули заедно с оптимална честота от 6 скачки на седмица. Получават се от 30 до 40 х 109 сперматозоиди на седмица от един бик. За 50 седмична работна година при горе споменатото разписание и 10х106 сперматозоиди на осеменяване, тези цифри резултират в 200 000 дози на година.
Наблюдават се големи разлики в производството на сперматозоиди между различните бици поставени при еднакви условия. Развиват се методи за оценка за количеството и качеството на сперматогенезата при биците (Foote,1969; Amann, 1970). Тези изследвания показват, че разликите в производството на сперматозоиди се дължат на размера на тестисите. Измерването на размера на тестисите е лесно и степента на унаследяемост е висока, h2=0.67 (Coulter et al., 1976). Така, че вниманието към размера на тестисите се оказва важно при селекцията и преценката на бици.
Интензивни изследвания се провеждат и върху храненето и работата на биците и дълголетието им (Foote, 1998). Бързият растеж е важен за минимализиране на времето необходимо на бичетата да достигнат пубертет и да бъдат тестирани за ИО. За нещастие тези данни не са широко известни защото са публикувани в бюлетин (Bratton et al.,1959, 1961), но все пак класическо изследване се появява и в научно списание (Almquist, 1982). Алмквист винаги е бил открит за нови идеи и възможности. На една научна среща той раздава на всички бележници, които са широки 2,5 см., но затова пък са много дълги, за да напомни на хората, да не бъдат тесногръди. Братон е перфекционист и не публикува резултати ако не са завършени, дори да са разработвани повече от 10 години.

Генетична селекция на биците за мляко

Една от главните причини за внедряването на ИО е да се използват по ефективно мъжките разплодници, които предават превъзходна генетика за производство на мляко и те да бъдат достъпни за повече производители в млечното говедовъдство. Това е демокрация в акция. Елитните бици няма да бъдат ограничени само за богатите, но практикуваните процедури за селекция на бици преди ерата на ИО дават разочароващи резултати. Много бици с високи оценки при естествено заплождане не повтарят тези постижение и използване в ИО. Робъртсън и Рендел (1950) и Скотлан и Хентдерсон (1950) в Корнуелския университет започват работа с нови методи за селекция на разплодници (Van Vleck, 1981). Хендерсон продължава своите изследвания и създава принципи необходими за оптимална програма за селекция на разплодници и предлагане на обективни методи за компенсация на данните във връзка с различните влияния на околната среда.
Хендерсон е обучаван от д-р Лъш в Айова. Той комбинира тези си знания с математическите си умения и привлича аспиранти и учени от цял свят. Заедно с тези учени, Хендерсон има най-голямото влияние върху развитието на генетиката на млечното говедовъдство, от която и друга отделна личност в историята. Той е скромно личност, винаги готов да помогне с бележник в ръка за решаването на математическите проблеми на който и да го помоли. Той не се нуждае от модерен компютър защото е роден с такъв.

Замразена сперма

Докато генетиците правят пробиви в селекцията на разплодници, едно изумително постижение е докладвано от Англия (Polge et al., 1949), успешното замразяване на сперма от петел при включването на глицерин. Скоро след това е намерено, че глицерина е полезен и за замразяването на сперма от бици. Много изследователи са се опитвали да замразят сперма от бици. През втората половина на 40-те години на ХХ век Фути замразява сперма от бикове с добавка на етилен глицерин при – 10°С, но тези опити не успяват.
Случайността играе роля в откритието на Полдж 1968 г. Изследванията му се базират на използване на захари като криопротектори, но те не водят да успешни резултати. Все пак Полдж се връща към тези изследвания 6 месеца по-късно и резултатите са обещаващи; предполагаемо от същата бутилка от разтвор на фруктоза останал от преди. Защо сега са успешни? Какво има в бутилката? Химическите анализи показват, че бутилката не съдържа захари, но глицерин и протеин в пропорции, които съставят албумина на Майерс, използван в хистологията. Вероятно е била направена грешка при поставянето на етикетите на реагентите предназначени за съхранение.
Основният разредител използван от Полдж е оригиналния жълтъчно-цитратен разредител (Salisbury et al., 1941) плюс глицерин. Алмквист (O'Dell and Almquist,1957) разработват добра среда за криоконсервация на сперма от бици на базата на пълномаслено мляко и глицерин. Използването на жълтъчен буфер с трис -буфер и глицерин също дава отлична защита за сперматозоидите в свежа или замразена сперма. (Davis et al., 1963; Foote, 1998). Този разредител бързо става най-широко използваната среда в цял свят за криоконсервация на сперма от бици и сперма от много други животински видове (Iritani, 1980). Разфасовката на замразена сперма при използването на въглероден двуокис (сух лед) или течен азот е проблемна. Стъклените ампули често се чупят по време на замразяване или размразяване. Касу (1964) модифицира системата разработено ат Сьоренсен (1940) с метод на запояване на пластмасови сламки (пайети) и пистолет за осеменяване (Pickett and Berndtson,1974). Първоначално са използвани пайети с обем 0.5 мл, но по-късно пайетите с обем 0.25 стават по популярни, защото изискват по малко място за складиране.
Друга голяма промяна за складирането на сперма става през 50-те години на ХХ век на, когато от замразяване в сух лед при – 790С се преминава към замразяване в течен азот на -1960С . Изследванията показват че преживаемостта на спермата при -1960С градуса е фактически безкрайна, докато при съхраняване на – 790 настъпват биологични изменения. Също така съхраняването със сух лед е неудобно и е необходимо постоянно добавяне. Съхраняването в течен азот също е проблематично, защото изолацията на контейнерите е неефективна, необходимо е често допълване за поддържане на температура от – -1960С. Производителите на такива контейнери не са заинтересовани да ги подобрят докато J. Rockefeller Prentice, собственик на American Breeders Service, дава значителна парична сума, която убеждава Linde Division of the American Cyanamid Company, че има пазар за контейнери за течен азот с подобрена изолация. Успешната криоконсервация на сперма и разработването на ефективен контейнери за течен азот дават основата върху, която е изградена цялата съвременна индустрия за криоконсервация.
Замразената сперма е по-малко фертилна отколкото свежата сперма (Shannonand Vishwana (1995). Изпитани са много добавки за повишаването на фертилността на замразена сперма, но с минимален успех (Foote, 1999). Все пак скорошен доклад (Amann et al., 1999) дава предварителна поддръжка на един пептид, който повишава фертилността ако бъде добавен към размразена сперма.

Откриване на еструс, синхронизация и време на осеменяване

Явно, че успеха на практика зависи от правилното откриване на еструса и правилното осеменяване. Класическото правило което е наречено сутрин-следобед и следобед-сутрин е създадено от Тримбергер (1948). То се базира на наблюдения, палпация на яйчниците и данни от осеменяванията. Правилото казва, че най-добра фертилност показват кравите, които са били забелязани за първи път в еструс сутринта трябва да бъдат осеменени следобеда на същия ден. Крави забелязани в еструс следобед трябва да бъдат осеменени преди обед на следващия ден. Тримбергер е отличен наблюдател и един от най-успешните треньори на международните съдии за оценка на крави.
Точното определяне на еструса е проблем в много ферми (Foote, 1975). Интензивни изследвания за регулиране на еструса продължават повече от 50 години (Ulberg et al., 1951; Hansel and Trimberger,1952) Заплодяемостта е много ниска в първите разработки за синхронизиране на еструса (Hansel and Convey, 1983). В много случаи заплодяемостта е много ниска, но кравите могат да бъдат осеменени във фиксирано време без откриване на еструс (Nebel et al., 2000). Раусън през 1971 г. предсказва, че изкуственото осеменяване заедно с овулацията, синхронизацията на еструса и манипулация на ембрионите ще доведе до голям напредък в животновъдството, много повече отколкото самостоятелното използване на ИО. Раусън е изумителен работник с великолепно чувство за хумор. Много изследователи идват в Кеймбридж, за да почерпят от опита му. Жените също играят ключова роля. Само някои от тях са осеменители, но приемайки позвъняванията на фермерите и миейки стъклените лабораторна съдови преди откриването на пластмасата е важен принос към колективната работа.

Сексирана сперма

В най-ново време едно от най-драматичните събития в техническия прогрес е сексирането на сперма чрез определянето на количеството на ДНК при използването на апаратура за проточна цитометрия разработена от Livermore Laboratories (Gledhill, 1985) и подобрена от (Johnson and Seidel, 1999). Времето необходимо за сортирането на милиарди сперматозоиди от един еякулат ограничава широкото практическо приложение, но апаратурата става все по-бърза.

Лиофилизация на сперма

Успешна лиофилизация на сперма от бици е докладвана погрешно от Мериман през 1960 г. (see Graham et al., 1974 for references). Опити на много изследователи да повторят тези изследвания дават негативни резултати. Все пак Грахам 1974 г. произвежда една бременност. Ако тогава е била достъпна техниката на микроинжектиране, Грахам щеше да работи неуморно стартирайки обикновено в 5 часа сутринта и търсейки други начини за използване на ИО. С техниката на микроинжектиране запазването на целостта на ДНК на лиофилизирани сперматозоиди е демонстрирано от (Wakayama and Yanagimachi, 1998).

Развитие и използване на ИО при други ССЖ

Месодайни говеда

В САЩ месодайните говеда са много повече от млекодайните. Технологията на обработка на сперма и осеменяване на месодайните крави е подобна на тази при млекодайните, но управлението на месодайните крави в ИО е по-трудно. Много крави се намират на обширни пасища, където откриването на еструса и събирането на животни за осеменяване е икономически неефективно. Поради това делът на говедата осеменявани изкуствено е малък (Foote,1981; Dziuk and Bellows, 1983). Там където малки групи от месодайни крави се отглеждат в заграждения, еструс цикъла може да бъде синхронизиран с различни препарати и кравите да бъдат осеменени изкуствено поне веднъж. В програмите за хибридизация ИО има предимство понеже използването на сперма е по-евтино отколкото отглеждането на бици от различни породи.

Свине

ИО на свине най-напред е започнато от Иванов в Русия в началото на ХХ век (Ivanow, 1907; Ivanoff, 1922). По-интензивни изследвания са проведени през 30-те години на ХХ век (Milovanow, 1938; Anderson, 1945; Maule, 1962; Nishikawa,1964). Ранни изследвания са провеждани в САЩ в Мисури (McKenzie, 1931), в Япония през 1948 (Ito et al., 1948; Niwa, 1958), в Запдна Европа през 50-те години на ХХ век (Polge, 1956). Нерезите се обучават лесно да заскачат манекени (Milovanov, 1938; Polge, 1956). Всички изкуствени вагини разработени за получаване на сперма от нерези дават възможност за прилагане на налягане към главата на пениса (McKenzie, 1931; Ito et al., 1948; Polge, 1956), или за тази цел се използва ръка облечена в ръкавица. МакКензи обучава много добри репродуктивни физиолози (Andrews,Casida, Phillips, etc.). Той посещава конференции по зоотехника дълго след като официално е пенсиониран. На 75–та конференция на американската асоциация по животновъдни науки, където са поканена много от дългогодишните членове, той заема първо място с членство от 61 години.
Руски разредители за сперма от нерези са базирани на глюкозни разтвори с натриево калиев тартарат или натриев сулфат и пептон поддържайки концентрацията на електролитите ниска (Milovanov, 1938; Anderson, 1945;Polge, 1956; Maule, 1962). Препоръчаната температура за съхранение е от 70С до 120С. Но Ито и сътрудници (1948) препоръчват температура на съхранение 15-200С. Когато са разработени жълтъчно-фосфатни, жълтъчно-цитратни и млечни разредители за сперма от бици, те са използвани или модифицирани за сперма от нерези включително (Polge, 1956; Niwa, 1958; Maule, 1962), и за охладена сперма.
Големи усилия са положени за замразяване на сперма от нерези след успешното използване на замразена сперма от бици (Nishikawa,1964; Graham, 1978; Iritani, 1980; Johnson and Larsson,1985; Johnson and Rath, 1991; Rath et al., 1996;Johnson, 1998; Foote, 1999; Johnson and Guthrie,2000). Много модификации на разредители и процедури на замразяване са разработени (Johnson, 1998), включително и метода на замразяване в гранули, който първоначално е развит в Япония (Nagase and Graham, 1964). Заплодяемостта и броя на родените прасета намаляват при използването на замразена сперма от нерези, така че използването на замразена сперма е ограничено до специалните развъдни програми. Свежо разредена сперма се използва при 99 % от изкуственото осеменяване на свине. Бързият транспорт на разредена сперма дава възможност на фермерите да се възползват от комерсиално произведената сперма от нерези. Големи корпорации увеличават използването на най-добрите си нерези при прилагане на ИО. Осеменяването се извършва от работниците във фермата с обем на една доза 80 мл. и концентрация 3х109 сперматозоида. Повече от 50 % от свинете в САЩ се осеменяват изкуствено и около 80 % се опрасват с повече от 10 прасенца на прасили. ИО на свине нараства с феноменални темпове.
Техниките за преценка на качеството на преценка на сперма от нерези са подобни на тези използвани при бици (Johnson, 1998). Сексирането на сперма от нерези е възможно, но е твърде бавно за да бъде произведена сексирана сперма за комерсиално използване. Откриването на еструса при свинете е сравнително лесно, защото повечето от тях идват в еструс до една седмица след отбиването на малките. Повече технически детайли могат да бъдат намерени в цитираните референции.

Коне

Изследванията по ИО на коне започват в Русия през 1899 г. (Ivanow, 1907; Ivanoff, 1922), стимулирани особено от нуждите на армията от коне. Ишикава започва подобни изследвания в Япония през 1912 г. (Sato, 1916; Nishikawa,1962). Книгата на Нишикава дава отличен преглед на тези интензивни детайлирани изследвания от един голям изследовател и учител и изключителен джентълмен.
Маккензи и други (1939) и Берлинер (1942) започват изследванията по получаване обработка и осеменяване на сперма от жребци и магарета в САЩ.
Най-ранното получаване на сперма е ставало чрез поставяне на гумен плик за събиране на спермата във вагината на кобила в еструс. През 30-40-те години на ХIХ век са разработени различни модели изкуствени вагини (Anderson, 1945;Maule, 1962; Perry, 1968; Davies Morel, 1999) и от тогава много от тях са модифицирани. По-малка и по-лека версия е разработена от Нишикава (see Davies Morel, 1999). Преценката на спермата става подобно на тази от сперма на бици.
Военните конюшни предлагат удобен източник на жребци (Anderson, 1945; Maule, 1962), но след втората световна война много от тях за закрити защото броят на конете намалява. В допълнение ограничаващите регулации за използването на ИО при много развъдни организации в коневъдството възпрепятства изследванията и внедряването та ИО. През този период Китай е основната страна използваща ИО.
Напредъкът постигнат при криоконсервацията на сперма от бици стимулира интереса за криоконсервация и на сперма от жребци. Резултати от изследванията са сумирани в материалите на много конгреси (Nishikawa, 1964, 1972; Bonadonna and
Succi, 1976; Sharp and Bazer, 1995) и също Дейвис Морел (1999). Въпреки, че са разработени методи за замразяване на сперма от жребци, повечето осеменявания в коневъдството се правят с охладена разредена сперма, която се използва до 48 часа от получаването през пролетния размножителен сезон. Размножителния сезон може да бъде удължен с предоставяне на допълнително осветление през есента.

Овце и кози

Ранни разработки за ИО на овце са започнати на широк фронт в Русия (Milovanov, 1938, 1964; Maule, 1962), където колхозите създават идеална възможност за прилагане на програми по ИО. Китай също има интензивна програма за ИО на овце. ИО се разпространява в Централна Европа след това намира широко комерсиално приложение във Франция и Бразилия (Anderson, 1945; Maule, 1962; Foote, 1999). Техниките за получаване на сперма и ИО на овце и кози са описани в детайли (Evans and Maxwell, 1987). Качеството на спермата и ефективността на заплождане се влияят от сезона.
Кочовете и пръчовете могат да бъдат обучени да работят с изкуствена вагина. За получаването на сперма от голям брой кочове в практиката, електроеякулацията е резултатна процедура, приложена за първи път от Гън 1936 г. и е използвана при много други видове животни (Dziuk et al., 1954). Много от ранните изследвания в западния свят върху разредители на сперма, замразяване на сперма и техника на ИО са правени от Еменс и Блакша, последвани от Саломон и Максуел в Австралия и Даузиер, Колас и Кортел във Франция (Corteel, 1981; Salamon and Maxwell,
1995a,b; Maxwell et al., 1999).
Замразяването на сперма от пръчове е по-успешно от криоконсервацията на сперма от кочове. Техниките и средите за замразяване на сперма като жълтъчно-трис-глицеринови разредители са модифицирани (Corteel, 1981; Salamon and
Maxwell, 1995a; Maxwell and Watson, 1996; Amoah and Gelaye, 1997) от процедурите разработени за сперма от бици (Davis et al., 1963).
Използването на замразена сперма при козите дава задоволителна фертилност при условие че спермата е аплицирана дълбоко цервикално или в тялото на матката. При овцете това е трудно постижимо. Поради това маточното осеменяване с лапароскоп е необходимо за постигането на висока фертилност при тях. В по-ново време Максуел 1999 г. използва успешно интрацервикално осеменяване при добавяне на семенна плазма към криоконсервирана сперма от кочове преди използването й за осеменяване.

Птици

ИО намира широко разпространение в птицевъдството. Получаването на сперма са разгледани от Sexton (1979) и Lake (1986) по-късно от Donoghue and Wishart (2000). Пионери в ИО на птици са Буроус и Куин 1937 г. които разработват метод за абдуминален масаж и натиск за получаване на сперма. Поради лесното получаване на сперма от птици и достатъчното количество птици в големите развъдни ферми, ИО е използвано интензивно със свежо получена сперма. Използва се 100 % за оплождането на пуйки, тъй като там естественото покриване е трудно. Свежо получена сперма от петел е една от първите типове сперма, която е била замразена (Shaffner et al.,1941; Polge et al., 1949). Въпреки това криоконсервираната сперма от птици е с намалена фертилност и замразяването на сперма от птици е все още в експериментална фаза (Gill et al., 1999).

Други домашни бозайници

Въпреки, че кучето е едно от първото животно при, което е документирано ИО този метод при него се използва само при специални случаи например при развъждането на кучета водачи или за справянето със специално проблеми. Много развъдни киноложки организации не регистрират кученца получени от ИО. Криоконсервацията на сперма от кучета е успешна при използване на модификации от жълтъчно-трис и жълтъчно-лактозни разредители разработени за криоконсервация на разредители за сперма на бици (Foote, 1990).
Зайците са използвани интензивно като модел за едрите животни и хората (Foote, 1998; Foote and Carney,2000). Всички репродуктивни техники прилагани при ССЖ могат да бъдат разработени върху зайците като евтин модел, и някои характеристики на плацентарната мембрана ги правят особено ценни за изследвания в хуманната тератология (Foote and Carney, 2000).

Застрашени видове бозайници

Първата репродуктивна биотехнология използвана за съхраняване на застрашени видове е изкуственото осеменяване (Wildt et al., 1995). Отново, много от използваните принципи и процедури са адаптирани от говедовъдството. (Watson, 1978).

Приложения

В първоначалните стадии на разработване на изкуственото осеменяване има много препятствия. Общественото мнение е против каквито и да било изследвания свързани с половия акт. Във връзка с това е страхът, че ИО ще доведе до уродства. В допълнение е трудно да се осигури финансиране за изследователската дейност защото влиятелни фермери са против ИО, тъй като мислят, че то ще унищожи пазара за бици. Добре организираните практически изследвания придружаващи ИО скоро показват на селскостопанската общност, че правилното прилагането на тази технология може да подбере превъзходни бици за производството, свободни от летални гени, контролира венерическите заболявания и произвежда здрави телета. Тези позитивни факти надмогват страха. Университетските консултанти изиграват важна роля за разпространяването на тези факти.
Знанията получени от практическото прилагане на ИО са изключително полезни за по-нататъшното развитие на всяка успешна репродуктивна технология, като замразяване на сперма, супер овулация, ембриотрансфер и евентуално клониране. Наред с това обществото е по-добре информирано и готово да приеме нови технологии с достойни цели, които са в рамките на етични норми и могат да доведат до положителни изменения и ползи за цялото общество. Достойни цели, развитието на необходими знания и умения, етични решения, всички те са основни компоненти на всяка технология, която резултира в положително влияние за обществото и околната среда. Така че влиянието на ИО е много по-широко от това то да бъде разбирано само като един друг начин за заплождане.

 

ИЗГОТВИЛ,
ДИАНА БОСАШКА
Главен експерт по репродукция
в ГД УГРРП


По материал на
R. H. FOOTE
Department of Animal
Science, Cornell
University, Ithaca